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Tipo do documento: Dissertação
Título: Clonagem e expressão regulada do cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori em Pichia pastoris
Autor: Carmo, Edson Junior do 
Primeiro orientador: Astolfi Filho, Spartaco
Primeiro membro da banca: Lozano, Jorge Luis López
Segundo membro da banca: Schenberg, Ana Clara Guerrini
Terceiro membro da banca: Willerding, André Luis
Quarto membro da banca: Silva, Leonor Alves de Oliveira da
Quinto membro da banca: Azevedo, João Lúcio de
Resumo: A utilização de produtos biotecnológicos, especialmente proteínas e enzimas no setor industrial, tem aumentando significativamente em nível mundial. A glicoamilase é uma das principais enzimas responsáveis pela hidrólise do amido para a formação de xarope de glicose, matéria-prima utilizada pela indústria de alimentos e como fonte de carbono em processos fermentativos diversos. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para expressão de várias proteínas de interesse biotecnológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de expressão heteróloga utilizando a levedura P. pastoris para a produção da enzima. O cDNA da glicoamilase isolado do fungo Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 foi inserido no genoma de P. pastoris utilizando o vetor de expressão pPIC9, baseado no promotor AOX, gerando clones recombinantes de fenótipos Mut+ e MutS cultivados sob agitação constante para a produção e secreção da proteína. As atividades das enzimas foram avaliadas utilizando o método DNS que quantifica açúcares redutores resultantes da clivagem das moléculas de amido. A máxima atividade enzimática observada no sobrenadante bruto do clone com fenótipo Mut+ foi 7.7 U/mL e do clone transformante MutS foi 6.9 U/mL. Os dois clones secretaram glicoamilases com 116 kDa que apresentaram diferentes poder catalítico, mas foram bioquimicamente semelhantes, com mesma temperatura de atividade ótima a 60ºC, elevada ação catalítica em pH ácido que varia de 4.5 a 2.5 com atividade máxima em pH 3.5 e suas estabilidades frente ao pH do meio de reacional, possuindo portanto, características desejáveis para uso em alguns processos bioindustrias. Ambos os produtos se mantiveram estáveis quando os extratos brutos foram incubados a temperatura de 4Cº por 60 dias, mantendo perto de 100% da atividade máxima. No entanto, a enzima produzida por P. pastoris Mut+ apresenta maior estabilidade térmica, retendo cerca de 70% de atividade residual quando incubada por 60 minutos a 60Cº, contra menos de 10% de atividade residual observada para a enzima expressa pelo clone MutS, avaliada nas mesmas condições. Diferentes modificações pós-traducionais poderiam estar envolvidos na pronunciada diferença de estabilidade térmica das proteínas produzidas por P. pastoris que tem se mostrado um excelente sistema de expressão de proteínas.
Abstract: The utilization of biotechnological products, mainly proteins and enzymes in the industrial sector, has been increased considerably worldwide. Glucoamylase is of main enzyme responsible for the hydrolysis of starch for the formation of glucose syrup, raw material used by the food industry and carbon source in diverse fermentative process. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of some heterologous proteins of biotechnological interests. The aim of this work was to evaluate the system of proteins heterologous expression using the yeast P. pastoris for enzyme production. The glucoamylase cDNA isolated from Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 was inserted into P. pastoris genome using vector pPIC9, based in the AOX promoter, generating recombinant clones of Mut+ and MutS phenotypes and grown under constant agitation for enzyme production and secretion. Enzymes activity was measured utilizing DNS method that it quantifies resultant sugar-reducing of the breaking of starch molecules. Maximum enzymatic activity observed in the crude supernatant of Mut+ clones phenotype was 7.7 U/mL and MutS clones phenotype was 6.9U/mL. Both clones producing glucoamylases with 116 kDa that they had presented different to be able catalytic, but they had been biochemically similar with same temperature of optimum activity of 60ºC, high catalytic action in pH acid that it varies of 4.5 the 2.5 with maximum activity in pH 3.5 and its stability front pH of reaction way, possessing therefore, characteristics desirable for use in some processes bioindustries. Both the products if had kept steady when the crude extracts had been kept the temperature at 4Cº during 60 days, keeping close to 100% of the maximum activity. However, the enzyme produced for Mut+ P. pastoris presents greater thermal stability, holding back about 70% of residual activity when kept during 60 minutes at 60Cº, against less than 10% of observed residual activity for the express enzyme for MutS clone, evaluated in the same conditions. Different modifications post-translational could be involved in the sharp difference of thermal stability of proteins produced for P. pastoris that if it has shown an excellent system of protein expression.
Palavras-chave: Aspergillus awamori
Expansão gênica
Clonagem
Enzimas recombinantes
Pichia pastoris
Expressão heteróloga
Etanol
Área(s) do CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Idioma: por
País: BR
Instituição: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Sigla da instituição: INPA
Departamento: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
Programa: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
Citação: CARMO, Edson Junior do. Clonagem e expressão regulada do cDNA da glicoamilase de Aspergillus awamori em Pichia pastoris. 2010. 115 f. Dissertação (Mestrado em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva) - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, 2010.
Tipo de acesso: Acesso Aberto
URI: http://localhost:8080/tede/handle/tede/686
Data de defesa: 1-Abr-2010
Aparece nas coleções:Mestrado - (GCBEv)

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