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Use este identificador para citar ou linkar para este item: https://bdtd.inpa.gov.br/handle/tede/1826
Tipo do documento: Dissertação
Título: Clonagem e expressão heteróloga do gene codificante da α-Amilase de Bacillus licheniformis DSM13 em Pichia pastoris
Autor: Astolpho, Helber Abellini
Primeiro orientador: Astolfi Filho, Spartaco
Resumo: A manipulação genética de micro-organismos permite a produção de enzimas com alto valor biotecnológico com aplicação em vários processos industriais. A enzima α-amilase de Bacillus licheniformis é amplamente utilizada nas indústrias de álcool, açúcar, cerveja e panificação para a hidrólise do amido inicial, clivando as ligações glicosídicas α-(1,4). Um sistema de expressão de proteínas heterólogas que tem sido utilizado com sucesso é o sistema da levedura metilotrófica Pichia pastoris. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar o gene que codifica a α-amilase de B. licheniformis DSM13 na levedura metilotrófica Pichia pastoris e após analisar a proteína recombinante secretada. O gene foi inserido no genoma de P. pastoris utilizando o vetor pPIC9 sendo então produzida e secretada pela levedura. A atividade enzimática máxima foi observada no sobrenadante do clone B8 (345,4 U/mL). Houve variação quanto ao peso molecular da enzima entre os clones analisados por gel SDS-PAGE. A enzima apresentou temperatura ótima de atividade de 70ºC, considerável estabilidade na presença de cálcio, pH ótimo de 7,0 e também manteve-se estável por um período de dois meses quando incubada a 4 ºC. Os valores de Km e Vmáx aparentes calculado para o extrato bruto do clone A7 foram de 10,74 mg/mL e 416,66 U/mL respectivamente.
Abstract: Genetic manipulation of microorganisms allows the production of enzymes with high biotechnological value with application in various industrial processes. The enzyme α-amylase from Bacillus licheniformis is widely used in industries to produce alcohol, sugar and beer, and its activity involves hydrolysis of starch cleaving the glycosidic bonds α-(1,4). The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been used successfully for heterologous protein expression, becoming an efficient expression system. The objective of this study was to clone and to express the gene encoding α-amylase from Bacillus licheniformis DSM13 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and also to analyze the recombinant protein secreted. The gene was inserted into the genome of P. Pastoris using the pPIC9 vector and after the induction process the protein was produced and secreted by the yeast. The maximum enzyme activity was observed in the supernatant of the clone B8 (345,4 U/mL). Variations in molecular weight of the enzymes among the clones were detected by SDS-PAGE gel analysis. The enzyme showed optimum activity at 70 ºC, pH optimum of 7.0 and its activity remained stable for a period of two months when maintained at 4 °C. The Km and Vmáx apparent values calculated for the crude extract clone A7 were 10.74 mg/mL and 416.66 U/mL, respectively.
Palavras-chave: clonagem
expressão heteróloga
caracterização enzimática
Área(s) do CNPq: CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA
Idioma: por
País: Brasil
Instituição: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Sigla da instituição: INPA
Departamento: Coordenação de Pós Graduação (COPG)
Programa: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEv)
Citação: ASTOLPHO, Helber Abellini. Clonagem e expressão heteróloga do gene codificante da α-Amilase de Bacillus licheniformis DSM13 em Pichia pastoris. 2012. 82 f. Dissertação( Genética, Conservação e Biologia Evolutiva (GCBEv)) - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,Manaus .
Tipo de acesso: Acesso Aberto
Endereço da licença: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
URI: http://localhost:8080/tede/handle/tede/1826
Data de defesa: 7-Mar-2012
Aparece nas coleções:Mestrado - (GCBEv)

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